Nicolás Zabalegui

Trabajo original: Zabalegui, N., Manzi, M., Depoorter, A., Hayeck, N., Roveretto, M.,
Li, C., Pinxteren, M.V., Herrmann, H., George, C. and Monge, M.E.,
Seawater analysis by ambient mass-spectrometry-based seaomics. 
Atmospheric Chemistry and Physics 2020, 20(10), 6243-6257.

La composición química de la superficie del océano influye en los procesos fisicoquímicos que ocurren en la interfaz aire-agua al conectar la biogeoquímica del océano con la química atmosférica en la capa límite marina.¹ La microcapa superficial marina (SML) cubre hasta el 70 % de la superficie de la tierra y está enriquecida en materia orgánica disuelta.^1,2 Estudios en los que se utilizaron compuestos modelo para simular el contenido de materia orgánica disuelta en agua de mar han sugerido que la composición química de la SML influye en la formación de aerosoles atmosféricos a través de reacciones fotoquímicas que ocurren en la interfaz aire-agua.³ Por lo tanto, la caracterización química a nivel molecular de la SML permite vincular la composición del agua de mar con la de los aerosoles atmosféricos, los cuales impactan en la calidad del aire y el cambio climático.² El análisis de compuestos orgánicos disueltos en muestras de agua de mar involucra desafíos asociados a su alto contenido salino en contraste con los bajos niveles de concentración esperados para las distintas especies orgánicas disueltas.

La metabolómica es el campo que estudia los cambios en los niveles de metabolitos en sistemas biológicos mediante plataformas analíticas e informáticas sofisticadas.⁴ Un estudio metabolómico puede ser realizado de forma dirigida o no dirigida. Los estudios dirigidos se focalizan en la detección y cuantificación de un conjunto de metabolitos conocidos, mientras que los estudios no dirigidos tienen como objeto caracterizar la mayor cantidad posible de moléculas pequeñas en un sistema biológico ^5,6, como es el caso del metaboloma marino. La espectrometría de masas es una de las principales técnicas analíticas utilizadas para realizar estudios metabolómicos ^7,8. 

En la última década, se han desarrollado numerosas técnicas de análisis directo de muestras por espectrometría de masas en “condiciones ambientales”, ^9,10 en las cuales el proceso de desorción/ionización del analito se lleva a cabo a presión atmosférica en espacios abiertos, accesibles por el usuario, y constituyen una nueva herramienta en el campo de la metabolómica. En particular, la técnica de espectrometría de masas de Análisis Directo en Tiempo Real (DART-MS) involucra una fuente de ionización de plasma, y se caracteriza por una alta capacidad de análisis (high-throughput), en donde las etapas de preparación de muestra son mínimas.¹⁰ Por ejemplo, puede depositarse una mínima cantidad de masa de la muestra en un capilar de vidrio o en una malla de acero inoxidable, los cuales se ubican en la región del plasma durante unos pocos segundos, minimizando la contaminación cruzada y los efectos de memoria que pueden ocurrir en experimentos por cromatografía líquida. La identificación de las variables metabólicas no obstante, presenta varios desafíos. Por un lado, al no contar con una separación cromatográfica, los perfiles isotópicos de distintas variables pueden superponerse en mayor o menor medida, afectando de esta manera a las fórmulas moleculares generadas. Por otro lado, si bien es posible realizar experimentos de espectrometría de masas en tándem con esta plataforma, debido a la complejidad de la muestra y a la ausencia de una técnica separativa, es difícil y muchas veces imposible aislar al ion que se desea fragmentar de otras especies iónicas presentes, lo que resulta en un espectro de fragmentación complejo y difícil de interpretar. Vale la pena destacar que hasta el momento no hay descriptos en literatura estudios metabolómicos no dirigidos para evaluar sistemas marinos utilizando técnicas de espectrometría de masas en condiciones ambientales.

En el presente trabajo, se desarrolló un método analítico basado en espectrometría de masas en condiciones ambientales para analizar compuestos lipofílicos en muestras de agua de mar no desalinizadas, colectadas durante una campaña en las islas de Cabo Verde en septiembre de 2017, con el fin de estudiar el efecto de la composición de los compuestos orgánicos disueltos en las muestras de agua y lograr diferenciar las muestras según su procedencia y en función de los procesos de formación de aerosoles que puedan generar estas muestras en la interfaz aire-agua. Se utilizó la técnica de análisis directo en tiempo real (DART) acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución con analizador de cuadrupolo tiempo de vuelo (QTOF) para desarrollar un método con alta capacidad de análisis, mínima preparación de muestra y que no requiera una etapa previa de desalinización de muestras. Con el objeto de aumentar la reproducibilidad y disminuir el riesgo de contaminación cruzada, se implementó una geometría denominada modo transmisión (TM), en donde el flujo de gas atraviesa directamente a las muestras depositadas en una malla de acero inoxidable.

La estrategia de metabolómica no dirigida aplicada en el presente trabajo se diseñó con el objeto de discriminar las muestras de agua de mar según hayan sido colectadas en la superficie del océano o a un metro de profundidad de acuerdo a los niveles o abundancias de sus compuestos orgánicos disueltos. 

La figura 1 resume las distintas etapas del esquema de trabajo de la plataforma analítica TM-DART-QTOF-MS empleada para el análisis de muestras de agua de mar colectadas en Cabo Verde:  

Figura 1: Esquema que ilustra la estrategia analítica implementada en CIBION-CONICET (Argentina) para el análisis de muestras de agua de mar liofilizada utilizando TM-DART-QTOF-MS.

Las muestras de SML fueron colectadas manualmente por el método tradicional de la placa de vidrio ¹¹ (GP) y por un dispositivo automático denominado MarParCat (CAT) basado en placas de vidrio rotativas. Las muestras de agua subyacente (ULW) fueron colectadas a un metro de la superficie durante el mismo período de tiempo que las muestras SML, utilizando análogamente dos estrategias de muestreo, muestreo manual (GP) y muestreo por medio de MarParCat (CAT). Se colectaron en total 22 muestras, con un total de 10 muestras pareadas (colectadas en el mismo sitio) y 2 muestras restantes de agua subyacente no pareadas.

Las muestras se descongelaron a 4 °C durante 5h; no fueron desalinizadas ni filtradas. Luego se dividieron en alícuotas de 8 mL y posteriormente fueron congeladas a -20 °C hasta su liofilización. Se prepararon controles de calidad mezclando volúmenes iguales de todas las muestras (incluyendo ambos métodos de colección) antes de realizar el proceso de liofilización; este control de calidad se denominó QC_ALL. Por otro lado, luego de extraer los metabolitos y reconstituir las muestras en acetonitrilo se mezclaron volúmenes iguales de todas las muestras, este control de calidad se denominó QC_MIX22. Se prepararon blancos de preparación de muestras utilizando agua ultra pura (WB), de manera análoga a las muestras de agua de mar. El mismo protocolo de preparación de muestras también se utilizó para preparar muestras de agua comercial (CSW), las cuales fueron utilizadas para el desarrollo del método analítico. Las muestras liofilizadas fueron enviadas desde TROPOS (Alemania) a CIBION-CONICET (Argentina), donde se almacenaron a -80 °C hasta que se produjo el análisis de TM-DART-QTOF-MS. Los residuos liofilizados se reconstituyeron en 1200 μL de acetonitrilo, con un factor de concentración de 6,67. Las muestras reconstituidas se mezclaron durante 5 min en vortex para favorecer la extracción de metabolitos y luego se centrifugaron durante 10 min a 4861 g y 20 °C, proceso que dio como resultado la obtención de un pellet de sal. Finalmente, para cada muestra se recolectaron 500 μL de sobrenadante para realizar los análisis.

En lo que respecta al pre-procesamiento de datos, inicialmente se definió una masa de referencia (lock-mass) para poder corregir las derivas de las masas exactas adquiridas a lo largo del experimento. Esto fue realizado por medio del software Progenesis Bridge (Waters Corporation, Milford, Massachusetts,USA). Posteriormente se utilizó el software Progenesis QI, versión 2.1 (Nonlinear Dynamics, Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA), para extraer las variables metabólicas. Con este programa se identificaron e integraron las señales de cada una de las variables, para finalmente lograr obtener las áreas correspondientes (peak picking) en una matriz de datos. Solo las muestras SML y ULW fueron consideradas a lo largo del proceso de peak picking. Este proceso dio como resultado la obtención de una matriz de 889 variables.

Una vez obtenida la matriz de variables se aplicó un procedimiento estadístico denominado LOESS¹² para corregir la fluctuación temporal de las señales de cada variable a lo largo del tiempo total de adquisición del experimento. Luego de realizar la corrección de cada lote por LOESS, aquellas variables con un desvío estándar relativo (RSD) superior al 30% en los controles de calidad QC_MIX22 fueron descartadas; y solo aquellas variables con una intensidad promedio en las muestras mayor a 5 veces en comparación con los blancos fueron retenidas. Finalmente, se realizó un curado manual de la matriz para eliminar picos redundantes, retener variables con un perfil isotópico adecuado y contemplar limitaciones de resolución observadas en el proceso de peak picking. Se obtuvo una matriz curada de 51 variables la cual fue normalizada luego por área total. Los valores de abundancia de los triplicados técnicos fueron promediados, excepto para la muestra SML GP2 para la cual solo se consideraron dos réplicas. Las matrices obtenidas antes y después de promediar las réplicas técnicas se utilizaron para realizar análisis estadísticos multivariados y construir modelos supervisados y no supervisados utilizando el programa MATLAB R2015a (MathWorks, Natick, Massachusetts, EE. UU.) en conjunto con el programa PLS_Toolbox versión 8.1 (Eigenvector Research, Inc., Manson, Washington, USA). Las técnicas de análisis de componentes principales (PCA) y t-SNE se utilizaron para evaluar la calidad de los datos, reducir la dimensionalidad de los datos e identificar potenciales outliers en el conjunto de datos, así como para identificar clusters de muestras y evaluar la reproducibilidad del método analítico.

La gráfica de scores que se desprende del PCA (figura 2a), una técnica lineal de reducción de la dimensión de los datos, muestra una clara separación entre los blancos de solvente (ACN), los blancos WB, las muestras CSW y las muestras de agua de mar recolectadas durante la campaña (SML, ULW). Si bien las mayores diferencias están dadas entre los distintos blancos empleados y las muestras de agua de mar, las muestras de agua de mar de Cabo Verde (SML, ULW) lograron ser discriminadas de las muestras CSW. Además, los controles de calidad QC_MIX22 se muestran agrupados, lo que indica reproducibilidad en el método de preparación de muestras,  datos de buena calidad y un desempeño adecuado de la plataforma analítica. Los resultados proporcionados por el modelo t-SNE (figura 2b), que es una técnica no lineal de reducción de dimensionalidad de los datos, concuerdan con los resultados obtenidos por PCA y enfatizan la reproducibilidad del método analítico empleado para el análisis de las muestras de agua de mar colectadas en Cabo Verde. 

Figura 2: a) Gráfico de scores que se desprende del PCA en el cual se muestran las primeras dos componentes principales, y (b) gráfico bidimensional que se desprende del modelo t-SNE. Las muestras de agua de mar están representadas con círculos y los blancos con cuadrados. WB – blancos de preparación de muestras con agua ultrapura (gris); QC_ALL: muestra combinada de todas las muestras de agua de mar previo al proceso de liofilización (violeta); QC_MIX22: muestra combinada de todas las muestras de agua de mar reconstituidas (rosa); SML – muestras de agua de la microcapa superficial marina (azul claro); ACN – acetonitrilo (rojo); CSW – muestras de agua de mar comercial (dorado); y ULW – muestras de agua subyacente (negro). 

El modelo ortogonalizado de Análisis Discriminante con Proyección a Estructuras Latentes (oPLS-DA) ¹³ acoplado a un método de selección de variables utilizando un algoritmo genético (GA), fue utilizado posteriormente para encontrar un panel de variables reducido que maximizara la exactitud en la clasificación para la comparación binaria de las muestras SML y ULW. Mediante la implementación de  estos métodos de análisis estadístico multivariado se aisló un panel de 11 especies iónicas que permitió discriminar muestras de SML de muestras pareadas de agua subyacente (n=20), tal como se indica en la figura 3.

Figura 3: (a) Gráfico de scores que se desprende del PCA en el cual se muestran las primeras 3 componentes principales. SML – muestras de agua de la microcapa superficial marina (azul claro); y ULW – muestras de agua subyacente (negro). El PCA se realizó en base a 51 variables metabólicas extraídas promediando los valores de las réplicas técnicas utilizadas.
(b) Gráfico de predicción del modelo oPLS-DA realizado con validación cruzada (CV) empleando muestras SML (azul claro) y ULW (negro). La exactitud, sensibilidad y especificidad calculadas con validación cruzada fueron del 100%.
(c) Gráfico de scores que se desprende del PCA en el cual se muestran las primeras 3 componentes principales. SML – muestras de agua de la microcapa superficial marina (azul claro); y ULW – muestras de agua subyacente (negro). El PCA se realizó en base a 11 variables discriminantes seleccionadas previamente por un algoritmo genético acoplado al modelo o-PLSDA.

Un subgrupo de estas muestras (n=5) se utilizó para contrastar los resultados con experimentos de campo de generación de aerosoles orgánicos secundarios, los cuales fueron llevados a cabo durante la campaña en Cabo Verde en septiembre de 2017. Los mismos proporcionaron evidencia de que la estrategia analítica adoptada puede ser utilizada para identificar a los compuestos orgánicos que son susceptibles de participar en los procesos de formación de aerosoles en la interfaz aire-agua.

Asimismo, se intentó asignar una identidad a cada una de las 11 variables discriminantes seleccionadas por el GA. A partir de los valores de masa exacta obtenidos con el espectrómetro de masas de alta resolución se generaron fórmulas moleculares para cada una de las 11 variables y también se realizaron experimentos de espectrometría de masas en tándem para reunir una mayor cantidad de información y contribuir de esa manera al proceso de identificación de variables. El análisis de iones producto detectados en experimentos de espectrometría de masas en tándem, junto con el análisis de pérdidas neutras, proporcionó información sobre los grupos funcionales y contribuyó a filtrar las fórmulas moleculares obtenidas previamente como resultado de considerar la masa exacta y el perfil isotópico. En términos generales, las variables discriminantes fueron identificadas presuntamente como ácidos grasos saturados, alcoholes grasos, péptidos, compuestos bromados y compuestos orgánicos que contienen boro en su composición química.

La identificación putativa del panel de variables discriminantes capaz de diferenciar las muestras SML de las muestras ULW proporcionó evidencia adicional para apoyar la formación de aerosoles orgánicos secundarios (SOA) detectada en los experimentos realizados en campo durante la campaña. El gráfico de scores que se desprende del PCA ilustrado en la figura 5 muestra que las muestras SML no se distinguieron en base al método de colección, es decir, GP o CAT, y también señala aquellas 5 muestras SML que adicionalmente fueron evaluadas para la formación de SOA durante los estudios de campo. Dos de estas 5 muestras analizadas en campo dieron lugar a la formación de aerosoles (CAT 8 y GP 10):

Figura 4: Gráfico de scores que se desprende del PCA realizado exclusivamente con muestras SML, utilizando la matriz con 51 variables promediando los valores de las réplicas técnicas utilizadas. Aquellas muestras que fueron evaluadas para la formación de partículas durante la campaña de Cabo Verde se indican con círculos (condujeron a la formación de SOA) y rectángulos (no condujeron a la formación de SOA).

A partir de estos resultados, se construyó un modelo de PCA contemplando solo aquellas 5 muestras que fueron analizadas tanto por la estrategia TM-DART-QTOF-MS como en experimentos de campo de generación de aerosoles orgánicos secundarios. La figura 5 muestra que la segunda componente principal claramente separa las muestras de acuerdo a la formación de aerosoles:

Figura 5: Gráfico de scores que se desprende del PCA para muestras SML que fueron analizadas tanto con la estrategia TM-DART-QTOF-MS y que asimismo fueron analizadas en experimentos de campo de generación de aerosoles orgánicos secundarios; aquellas muestras que exhibieron formación de partículas se muestran con cuadrados verdes; las muestras que no exhibieron formación de partículas se muestran con cuadrados rojos.

Cuatro de las 7 variables con mayor valor absoluto en el gráfico de pesos (loadings plot) asociado a la segunda componente principal, y que contribuyeron principalmente a la separación de clases, fueron identificadas presuntamente como compuestos orgánicos que contienen boro. A pesar de las limitaciones asociadas con el bajo número de muestras utilizadas para realizar este análisis estadístico, estos resultados sugieren que las muestras SML que dieron lugar a la formación de partículas estaban enriquecidas con compuestos orgánicos que contienen boro y otras moléculas aún no identificadas. Se sabe que los compuestos que contienen boro se encuentran de manera generalizada en plantas vasculares, especies de algas marinas y microorganismos.¹⁴

A modo de conclusión, el método analítico basado en la estrategia TM-DART-QTOF-MS acoplado a análisis estadístico multivariado permitió estudiar la composición orgánica de las muestras SML y ULW colectadas en las islas de Cabo Verde, sin la necesidad de desalinizar las mismas. La estrategia fue implementada de manera exitosa logrando discriminar las muestras SML de las muestras ULW. La identificación tentativa del panel de metabolitos discriminantes sugiere que compuestos halogenados, alcoholes grasos, y compuestos orgánicos que contienen boro están disponibles para procesos de transferencia y reacciones fotoquímicas en la interfaz aire-agua del océano.

Los resultados combinados de la estrategia TM-DART-QTOF-MS y los experimentos de formación de SOA realizados en campo sobre muestras SML sugieren que los compuestos orgánicos enriquecidos en la interfaz aire-agua pueden estar contribuyendo a la capacidad diferencial de formación de SOA de las muestras SML. Se trata de una estrategia que provee de nuevas oportunidades para mejorar la caracterización del contenido de materia orgánica en el agua de mar y descubrir compuestos implicados en la formación de aerosoles.

Referencias

1. Donaldson, D. J.; George, C., Sea-surface chemistry and its impact on the marine boundary layer. Environmental science & technology 2012, 46 (19), 10385-9.

2. P.S. Liss, R.A. Duce, editors. The sea surface and global change. xv, 519p. Cambridge University Press, 1997.  Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 2009, 77 (3), 918-918.

3. (a) Ciuraru, R.; Fine, L.; van Pinxteren, M.; D’Anna, B.; Herrmann, H.; George, C., Photosensitized production of functionalized and unsaturated organic compounds at the air-sea interface. Scientific Reports 2015, 5 (1), 12741; (b) Rossignol, S.; Tinel, L.; Bianco, A.; Passananti, M.; Brigante, M.; Donaldson, D. J.; George, C., Atmospheric photochemistry at a fatty acid–coated air-water interface. Science 2016, 353 (6300), 699.

4. (a) Zhang, A. H.; Sun, H.; Wang, P.; Han, Y.; Wang, X. J., Recent and potential developments of biofluid analyses in metabolomics. J. Proteomics 2012, 75 (4), 1079-1088; (b) Beger, R. D.; Dunn, W. B.; Bandukwala, A.; Bethan, B.; Broadhurst, D.; Clish, C. B.; Dasari, S.; Derr, L.; Evans, A.; Fischer, S.; Flynn, T.; Hartung, T.; Herrington, D.; Higashi, R.; Hsu, P.-C.; Jones, C.; Kachman, M.; Karuso, H.; Kruppa, G.; Lippa, K.; Maruvada, P.; Mosley, J.; Ntai, I.; O’Donovan, C.; Playdon, M.; Raftery, D.; Shaughnessy, D.; Souza, A.; Spaeder, T.; Spalholz, B.; Tayyari, F.; Ubhi, B.; Verma, M.; Walk, T.; Wilson, I.; Witkin, K.; Bearden, D. W.; Zanetti, K. A., Towards quality assurance and quality control in untargeted metabolomics studies. Metabolomics 2019, 15 (1), 4; (c) Nicholson, J. K.; Lindon, J. C., Systems biology: Metabonomics. Nature 2008, 455 (7216), 1054-6.

5. Fiehn, O., Kopka, J., Dormann, P., Altmann, T., Trethewey, R. N., and Willmitzer, L., Metabolite profiling for plant functional genomics, Nature Biotechnology 2000, 18 (11), 1157-1161.

6. Nicholson, J. K.; Lindon, J. C., Systems biology – Metabonomics. Nature 2008, 455 (7216), 1054-1056.

7. Clendinen, C. S.; Monge, M. E.; Fernandez, F. M., Ambient mass spectrometry in metabolomics. Analyst 2017, 142 (17), 3101-3117.

8. Weckwerth, W., and Morgenthal, K.: Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation, Drug Discovery Today 2005, 10 (22), 1551-1558.

9. Monge, M. E.; Harris, G. A.; Dwivedi, P.; Fernandez, F. M., Mass spectrometry: recent advances in direct open air surface sampling/ionization. Chem Rev 2013, 113 (4), 2269-308.

10. (a) Jones, C. M.; Monge, M. E.; Fernandez, F. M., Metabolite profiling by direct analysis in real-time mass spectrometry. Methods in molecular biology 2014, 1198, 275-89; (b) Monge, M. E.; Fernández, F. M., An Introduction to Ambient Ionization Mass Spectrometry. In Ambient Ionization Mass Spectrometry, Domin, M. A.; Cody, R. B., Eds. The Royal Society of Chemistry, RSC Publishing: Cambridge, 2014.

11. van Pinxteren, M., Müller, C., Iinuma, Y., Stolle, C. and Herrmann, H., Chemical characterization of dissolved organic compounds from coastal sea surface microlayers (Baltic Sea, Germany). Environmental science & technology 2012, 46(19), 10455-10462.

12. Dunn, W.B., Broadhurst, D., Begley, P., Zelena, E., Francis-McIntyre, S., Anderson, N., Brown, M., Knowles, J.D., Halsall, A., Haselden, J.N. and Nicholls, A.W., Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols 2011, 6(7), 1060-1083.

13. Trygg, J.; Wold, S., Orthogonal projections to latent structures (O-PLS). Journal of Chemometrics 2002, 16 (3), 119-128.

14. Dembitsky, V.M., Smoum, R., Al-Quntar, A.A., Ali, H.A., Pergament, I. and Srebnik, M., Natural occurrence of boron-containing compounds in plants, algae and microorganisms. Plant Science 2002, 163(5), 931-942.

---

---