Mansilla, Silvia Lorena

El cambio climático es considerado el factor de riesgo principal que facilita el desplazamiento de vectores desde áreas tropicales a templadas; y con ellos las enfermedades hemotrópicas asociadas. 

Sin embargo, los viajes con mascotas deberían ser considerados como un factor de riesgo contemporáneo. Tanto perros como gatos son considerados integrantes de las familias modernas, y se trasladan con los propietarios sin mayores requisitos que un plan sanitario y un certificado de buena salud. Sumado a esto los viajes aéreos han acortado las distancias, agravando la situación epidemiológica.

En el año 2004 en la Consulta de OPS/OMS de expertos sobre rickettsiosis en América, discutieron el aumento de éstas enfermedades y el riesgo que ello significa para la población humana. Como recomendaciones se propuso implementar y perfeccionar el sistema de vigilancia epidemiológica y de diagnóstico.  Es aquí donde la biología molecular brinda la posibilidad de llegar a un diagnóstico certero de las enfermedades trasmitidas por vectores. Lamentablemente no todos los países cuentan con ésta herramienta como parte de los servicios diagnósticos de rutina en medicina veterinaria de animales de compañía. La salud de perros y gatos debería ser considera una prioridad a nivel gubernamental en países en desarrollo, exigiendo un escaneo completo de enfermedades infecciosas para permitir su traslado.

La redistribución tanto de vectores (garrapatas, pulgas, piojos) como de las bacterias (Rickettsia sp) o parásitos (Babesia sp o Leishmania sp) es el resultado de actitudes humanas que afectan a la Salud, entendiendo como Salud a una sola: planeta-plantas y animales. 

ANTECEDENTES

El mundo experimenta una emergencia sanitaria en cuanto a las enfermedades trasmitidas por vectores como resultado de la interacción de factores medioambientales, ecológicos, sociales, económicos que facilitan la propagación de agentes infecciosos. Lo que representa un nuevo reto para los sistemas de vigilancia y la salud pública (Heras C. A. and Sierra Moros M.J. 2016).

Las enfermedades transmitidas por vectores constituyen un grupo de patologías consideradas como emergentes cuyos signos y síntomas clínicos son confusos y poco específicos. Dentro de las enfermedades hemotrópicas encontramos bacterias (Ehrlichia sp, Anaplasma platys, A. phagocytophillum, mycoplasma haemofelis, etc.) y parásitos (Leishmania sp, Babesia, Hepatozoonosis, Toxoplasmosis, Dirofilariosis y Tripanosomiasis).  Las últimas publicaciones coinciden en que todas ellas son zoonosis cada vez más frecuentes que afecta a la población humana. Debemos considerar que hay un gran número de personas en contacto diario con animales, ya sea porque lo consideran un miembro más de la familia, incluso duermen con ellos, o porque son semi propietarios proporcionando alimento y/o cuidado a animales vagabundos. El concepto de “One Health” (una sola salud) resalta la importancia del asesoramiento veterinario con respecto al riesgo de enfermedades emergentes y reemergentes en las personas y pone en evidencia la responsabilidad social que tienen los veterinarios en el diagnóstico que cada vez debería ser más preciso, acompañando del uso de técnicas que, como la biología molecular, permitan reconocer no solo a los clínicamente enfermos sino también a aquellos animales subclínicos que pudieran obrar como portadores

Las ehrlichiosis y anaplasmosis son causadas por bacterias gram negativas, intracelulares obligadas, pertenecientes al orden Rickettsiales, familia Anaplasmataceae, géneros Ehrlichia y Anaplasma (Dumler J. S. et al., 2001). Las enfermedades trasmitidas por vectores son consideradas enfermedades emergentes en humanos y animales. Las poblaciones caninas son grandes reservorios y centinelas para las enfermedades infecciosas y zoonóticas (Otranto et al., 2010). 

La ehrlichiosis canina es causada por una bacteria gran negativa intracelular obligada Ehrlichia sp (Neer et al., 2002) aunque hay reportes de ehrlichiosis canina causada por E.chaffeensis y E. ewingii (Breitschwerdt et al., 2014). La ehrlichiosis monocítica canina (EMC) causada por Ehrlichia canis es de importancia en salud animal por ser considerada de alta mortalidad en caninos domésticos, con distribución mundial (Harrus et al., 2011). 

El diagnóstico oportuno de la enfermedad es un desafío debido a las diferentes fases con que cursa la patología (subclínica, aguda y crónica) y sus múltiples manifestaciones clínicas. Clásicamente, la ehrlichiosis canina se presenta con trastornos multisistémicos caracterizados por apatía, depresión, letargo, pérdida de peso, fiebre, anorexia, en ocasiones vómito o diarrea con o sin hemorragia. Además, los caninos pueden presentar uveítis, polimiositis, poliartritis y alteraciones del sistema nervioso central, hepatomegalia y esplenomegalia. Los signos hematológicos asociados con mayor frecuencia son las petequias, epistaxis, trombocitopenia y anemia (anemia regenerativa en las fases agudas de la enfermedad y arregenerativa en la fase crónica). De las alteraciones presentes en el leucograma se destaca la neutrofilia con desvío a la izquierda en la mayoría de los perros que han sido natural o experimentalmente infectados. La leucopenia y monocitopenia son considerados hallazgos menos frecuentes (Waner T. and Harrus S., 2013). 

La anaplasmosis es causada por Anaplasma sp., presenta distribución mundial y causa la trombocitopenia cíclica infecciosa canina, afección generalmente leve, aunque con diversa patogenicidad en distintas regiones. La enfermedad puede cursar con fiebre, anorexia, petequias, uveítis, linfoadenopatía generalizada, leucopenia, anemia moderada y especialmente trombocitopenia, que ocurre en episodios de 3-4 días y a intervalos de 7-21 días, dando paso con el tiempo a una trombocitopenia crónica de lenta recuperación (Abarca et al., 2007) (Santos et al., 2009).

Ambas enfermedades, ehrlichiosis y anaplasmosis, son transmitidas a un hospedador susceptible por ninfas y adultos de la garrapata Rhipicephalus sanguineus sensu lato. El desarrollo hasta alcanzar los estadios infectantes está muy influido por las condiciones ambientales. La garrapata marrón del perro requiere tres hospedadores para completar su ciclo biológico que incluye huevo-larva-ninfa-adulto, para nudar de un estadio a otro debe alimentarse del mismo o distinto hospedador (Cicuttin G., 2008). La garrapata toma contacto con las bacterias al alimentarse de la sangre de un hospedador infectado y mantiene la infección en forma “transestadial”, mientras cambia de estadio (larva, ninfa y adulto). Al alimentarse de un hospedador sano trasmite el agente infeccioso adquirido previamente (Cicuttin et al., 2017).

En la provincia de Buenos Aires, Argentina, se confirmó la infección natural de caninos con E. canis y A. Platys. En dicho trabajo se analizaron un total de 114 muestras, 86 sospechosas y 28 como grupo control. Los resultados obtenidos por PCR confirmaron la infección con E. canis en 6 casos y 18 casos de A. platys. Además, se identificó coinfecciones con Hepatozoon canis y Babesia vogeli (Eiras et al., 2013).

En la provincia de Corrientes en 2011 se realizó un estudio para detectar la presencia de Anaplasma/Ehrlichia sp en garrapatas y pulgas de caninos domésticos de áreas urbanas. Para el análisis molecular fueron seleccionados ejemplares de Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma tigrinum y Ctenocephalides felis. Las muestras de R. sanguineus fueron positivas por PCR a la familia Anaplasmataceae (Oscherov et al. 2011). 

Por lo expuesto es factible sospechar que los caninos del Nordeste Argentino son afectados por varios géneros de la familia Anaplasmataceae, siendo ésta la causa de cuadros clínicos variados.

Actualmente las técnicas diagnósticas para confirmar los diagnósticos se están desarrollando de forma interdisciplinaria en nuestra región por nuestro grupo de investigación. Dicho desarrollo es fruto del trabajo en conjunto de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Facultad de Medicina e Instituto de Medicina Regional todos pertenecientes a la Universidad Nacional del Nordeste. El grupo es integrado por médicos veterinarios, biólogos moleculares, bacteriólogo y bioquímico, desde el 2018 se trabaja en la puesta a punto y estandarización de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) aplicadas al diagnóstico de hemoparasitos. 

ACTIVIDADES DESARROLLADAS

Recolección de muestras:
Se incluyen muestras de caninos de las provincias de Chaco, Corrientes, Formosa, Misiones y Norte de Santa Fe. Los meses de muestreo (ciclos) se determinan en función al vector, el cual tiene una actividad máxima en primavera y declina hacia el otoño en zonas tropicales y subtropicales (Cicuttin G.L., 2016). 

Se extraen 3 ml de sangre que se anticoagulada con 70 μl de EDTA (0,342 mol/l de sales sódicas y potásicas de ácido etilendiaminotetraacético) a los caninos con signos clínicos compatibles con ehrlichiosis o anaplasmosis. Además, se realizan al menos 5 frotis de sangre arterial periférica (FSAP) y sangre periférica (FSP) por cada paciente sospechoso para su posterior estudio en busca de mórulas intracitoplasmáticas en neutrófilos, monocitos y/o plaquetas. Cada extendido se fija con alcohol etílico al 9% durante 5 minutos y posteriormente son coloreados con una solución de Giemsa al 10% por 15 minutos. La observación microscópica se lleva a cabo con objetivo de inmersión y un aumento de 100x. Para cada muestra se confecciona una ficha clínica donde se detalla datos del paciente (especie, raza, edad, género, lugar de procedencia y lugar donde estuvo los últimos 3 años y los signos clínicos que presenten al momento de la toma de muestra). 

Los propietarios de los animales firman un consentimiento para el uso de la muestra en éste estudio. Los veterinarios de la actividad privada que envíen muestras sospechosas deberán adjuntar a lo anterior el consentimiento para la utilización de las muestras de sus pacientes.

Extracción de ácidos nucleicos:
Se utiliza un método comercial de extracción por columnas (High pure PCR template preparation kit, Roche), siguiendo las especificaciones del fabricante. 

Los ácidos nucleicos obtenidos serán almacenados a -20ºC hasta su utilización.

Detección molecular:
Actualmente se estandarizó la técnica PCR convencional y se están realizando las adaptaciones para el diagnóstico en PCR en tiempo real (qPCR) para detección de patógenos de la familia Anaplasmataceae, Ehrlichia sp y Anaplasma sp:

Detección de la flia. Anaplasmataceae, utilizando un primers 16S GE2´F2 HE3 (Monje et al., 2019) 

Luego se realizará la detección de Ehrlichia sp. Utilizando primers dsb 330/728 y dsb 321/671 (Doyle et al., 2005) (Aguiar et al., 2007).

Detección de Anaplasma sp con primers PLA-HS475F y PLA-HS1198R.

Para qPCR se utiliza colorante intercalante (Sybr green de cinética rápida de marca Roche) con determinación de temperatura de melting específica. Luego se estandarizará qPCR con sondas de hidrólisis.

Todas las reacciones se realizarán en un volúmen final de reacción de 10 μL.

Control interno: se lleva a cabo durante la puesta a punto de la técnica de qPCR, se incorpora un sistema de amplificación con control interno de ADN canino que permite detectar posibles falsos negativos originados por la presencia de inhibidores de la PCR en las muestras. 

Control de reactivos: Se utiliza agua estéril de grado molecular para detectar la contaminación cruzada durante la extracción de ADN y el procesamiento PCR. 

Control Positivo: para la PCR de la familia Anaplasmataceae se empleará ADN de Anaplasma centrale, A. marginale para evitar posibles contaminaciones. Además, se cuenta con ADN de Ehrlichia canis obtenido a partir de muestras propias. 

Control negativo: se utiliza agua estéril de grado molecular. Las muestras que resulten negativas a la técnica molecular de todos los patógenos en estudio son factibles de ser usadas como ADN de animales sanos.

Control de calidad de los ADN extraídos: se realiza un doble testeo, por un lado, se utiliza un espectrofotómetro UV (Nanodrop lite) para verificar calidad de los ácidos nucleicos, midiendo absorbancia a 260 y 280 nm, obteniendo el índice correspondiente. Adicionalmente, se busca un control genómico correspondiente a ADN canino para verificar la viabilidad del material extraído y purificado. (Peleg et al, 2010). 

Se logró secuenciar amplificado de Ehrlichia sp en un laboratorio de referencia nacional y se está realizando el estudio filogenético y taxonómico. El número total de muestras a secuenciar se determinará al finalizar la etapa de recolección y procesamiento de los 3 ciclos de muestreo. 

La secuencia obtenida será analizada utilizando BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999) buscando similitudes con secuencias depositadas en el GenBank. El equipamiento requerido es facilitado por el laboratorio ICIVET Litoral. Toda la información se exporta a la base de datos de un programa de análisis estadístico.

Con el trabajo realizado se pretende tener datos concretos del comportamiento de los agentes infecciosos y de la dinámica del vector en la región. Una vez identificados y diagnosticados los animales infectados se podrá realizar una comparación de cuadros clínicos y encontrar semejanzas y diferencias entre los cuadros clínicos en caninos del NEA.

Referencias

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Aguiar D.M., Cavalcante G.T., Pinter A., Gennari S.M., Camargo L.M.A., Labruna M.B. 2007 Prevalence of Ehrlichia canis (Rickettsiales: Anaplasmataceae) in Dogs and Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) Ticks from Brazil. Entomological Society of America. J. Med. Entomol. 44(1): 126-132. 

Breitschwerdt E.B., Hegarty B.C., Qurollo B.A., Saito T.B., Maggi R.G., Blanton L.S., Bouyer D. 2014. Intravascular persistence of Anaplasma platys, Ehrlichia chaffeensis, and Ehrlichia ewingii DNA in the blood of a dog and two family members. Parasit Vectors 7: 298-304. 

Carmen Amela Heras C. A. and Sierra Moros M.J. 2016. Vector-transmitted diseases. A new challenge for public health surveillance systems. Gaceta Sanitaria, Vol: 30, pages 167-169, ISSN 0213-9111, https://doi.org/10.1016/j.gaceta.2016.03.001.

Cicuttin G. De Salvo Mn, Nava S. 2017. Two novel Ehrlichias trains detected in Amblyomma tigrinum ticks associated to dogs in peri-urban areas of Argentina. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 53: 40-44

Cicuttin G. L. 2016. Especies de garrapatas duras presentes en la ciudad autónoma de Buenos Aires y su importancia en la salud pública. RAZ y EIE. 11: 5-9.

Cicuttin G.L. 2008. Presencia de garrapatas Rhipicephalus sanguineus en caninos de un barrio con necesidades básicas insatisfechas de la Ciudad de Buenos Aires. Revista Argentina de Zoonosis. 2: 56-61. 

Doyle C.K., Labruna M.B., Breitschwerdt E.B., Tang Y.W., Corstvet R.E., Hegarty B.C., Bloch K.C., Li P., Walker D.H., Mcbride J.W. 2005. Detection of Medically Important Ehrlichia by Quantitative Multicolor TaqMan Real-Time Polymerase Chain Reaction of the dsb Gene. Journal of Molecular Diagnostics. 7: 507-510.

Dumler J. S., Barbet A. F., Bekker C. P., Dasch G. A., Palmer G. H., Ray S. C. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combi. Int J Syst Evol Microbiol. 51: 2145-2165.

Eiras D.F., Craviotto M.B., Vezzani D., Eyal O. 2013. First description of natural Ehrlichia canis and Anaplasma platys infections in dogs from Argentina. Microbiology and Infectious Diseases. 36: 169-173

Hall T. A. 1999. BioEdit: a user friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids Symp. 41: 95-98.

Harrus S. And Waner T. 2011. Diagnosis of canine monocytotropic Ehrlichiosis (Ehrlichia canis): an overview. Vet J 187: 292-296. 

Instructivo High pure PCR template preparation kit-Roche.

Monje L.D., Fernandez C., Percara A. 2019. Detection of Ehrlichia sp. strain San Luis and Candidatus Rickettsia andeanae in Amblyomma parvum ticks. Ticks Tick-Borne Dis. 10: 111-114.

Neer T.M., Breitschwerdt E.B., Greene R.T., Lappin M.R. 2002. Consensus statement on ehrlichial disease of small animals from the infectious disease study group of the ACVIM. American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med 16: 309-315.

Oscherov E.B., Milano A.M.F., Lobo B., Anda P., Escudero R. 2011. Detection of Anaplasma platys and other pathogens in ectoparasites from urban hosts in Northeast Argentine. Rev Ibero- Latinoam Parasitol. 70: 42-48.

Otranto D., Dantas-Torres F. 2010. Canine and feline vector-borne diseases in Italy: current situation and perspectives. Parasites and vectors 3: 2-6.

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