V. Passucci¹

Con M. M. Areco² y G. Curutchet¹

Resumen

En Argentina, las principales fuentes de contaminación de los cursos de aguas naturales están constituidas por los basurales a cielo abierto y por los vertidos de efluentes industriales y cloacales sin o con escaso tratamiento. Un ejemplo de ello es la cuenca del río Reconquista que en la actualidad ha alcanzado altísimos niveles de contaminación, no solo de metales pesados como cinc, cobre, plomo y níquel, sino también, de nutrientes tales como nitratos y fosfato, que favorecen la eutrofización del cuerpo de agua. En los últimos años distintas especies de microalgas han sido estudiadas para la remoción o biotransformación de diversos contaminantes, así como para la obtención de metabolitos de interés comercial. Las microalgas que habitan este tipo de ambientes contaminados se encuentran adaptadas a condiciones extremas de contaminación, lo que representa una ventaja para ser utilizadas en estudios de remoción de metales pesados del medio. Estas condiciones de estrés, además muchas veces favorecen la producción de distintos metabolitos. Es bajo estas hipótesis que Chlorella sp. y Desmodesmus sp., fueron aisladas del río Reconquista, para evaluar su potencial de remediación de efluentes ácidos con metales pesados y/o exceso de nutrientes como lo son los fosfatos, nitritos, nitratos y amonio. Buscando obtener a lo largo del proceso metabolitos de interés, dándole un valor agregado al sistema.

Introducción

En las últimas décadas, el rápido aumento de la urbanización e industrialización han incrementado las problemáticas ambientales alrededor del mundo, desde emisiones gaseosas a la atmosfera potenciando el efecto invernadero, hasta las nuevas problemáticas ocasionadas por los contaminantes emergentes o incluso contaminantes persistentes, como los metales pesados(Khan et al., 2020; Peña-Guzmán et al., 2019; Liu et al., 2018). En el caso particular de los metales pesados, estos se pueden encontrar en el medio ambiente en concentraciones variables, en suelos, agua, aire e incluso en la materia biológica (Vareda et al., 2019). Si se habla de fuentes naturales, los metales pueden tener su origen por actividad volcánica, pero también por la meteorización y lixiviación de rocas y suelos. Sin embargo, a estas fuentes naturales de metales se les deben agregar las antropogénicas, las cuales incrementan sus concentraciones en el medio ambiente. Algunas de estas fuentes son: la minería, fundición y refinado; la combustión de combustibles fósiles; las metalúrgicas; curtiembres; galvanoplastias; entre otras industrias. Muchas de las cuales vierten sus efluentes con escaso o nulo tratamiento a los cuerpos de agua. (Vareda et al., 2019; Magdaleno et al., 2014)

Respecto a la problemática ocasionada por el vertido de efluentes a cuerpos de agua, si bien existen tecnologías convencionales para la eliminación de metales pesados (precipitación, evaporación, intercambio iónico, electrocoagulación, entre otros), éstas presentan diversas desventajas. Algunas de ellas son: los requerimientos energéticos elevados; remoción incompleta de metales; generación de grandes cantidades de lodos tóxicos u otros productos que deberán ser tratados para su disposición final; entre otras consideraciones (Suresh Kumar et al., 2015; Abas et al., 2013; Mehta & Gaur, 2005). En este sentido, diversos grupos de investigación han evaluado tecnologías alternativas de remediación a las antes mencionadas, utilizando microalgas en los procesos de remediación no solo de metales pesados, sino también de nitratos y fosfatos, entre otros contaminantes, y los resultados por ellos obtenidos han demostrado el potencial que tienen las microalgas para ser utilizadas en procesos de remediación ambiental, Zhao et al., 2018, Suresh Kumar et al., 2015, entre otros. De este modo el tratamiento de efluentes con microalgas se presenta como una posible alternativa a las tecnologías ya utilizadas en la remediación de efluentes industriales (Salam, 2019; Suresh Kumar et al., 2015; Mallick, 2002)

Las microalgas presentan la habilidad de adsorber los metales pesados presentes en el medio, así como también, la capacidad de revertir las condiciones ácidas favoreciendo la precipitación de los metales pesados presentes en solución (Salama et al., 2019). En este sentido, la utilización de microalgas resistentes a elementos tóxicos para la remediación de efluentes industriales puede asegurar una mejor eliminación de estos mediante una combinación de bioprecipitación, biosorción y captación continua por parte de la biomasa.

En la cuenca del Reconquista existen diversas problemáticas que pueden ser estudiadas desde diversas aristas, como la ecología, la física, la química, la biología, la bioquímica, entre otras, y que al mismo tiempo, son transversales a las problemáticas sociales y económicas propias de la región. Este río pertenece a la provincia de Buenos Aires y es uno de los cursos de agua con mayores niveles de contaminación en Argentina. Esto se debe no solo al elevado número de industrias que se sitúan a su alrededor, vertiendo sus efluentes con un escaso o nulo tratamiento, sino también al aporte de aguas residuales y basurales a cielo abierto, asociado a la problemática demográfica y social de esta región (Cantera et al., 2018; Tufo et al., 2018; Porzionato et al., 2015). La cuenca del río Reconquista atraviesa 18 municipios del Gran Buenos Aires y comprende 134 cursos de agua, abarcando una superficie de 1670 km². Algunos de los ejemplos de industrias situadas a lo largo de la cuenca son: curtiembres (Cr), fábricas de baterías (Pb), industrias químicas (fenoles, Hg, compuestos orgánicos complejos, y ácidos o álcalis que modifican el pH del cuerpo de agua receptor), y galvanoplastías (Cr, Zn, Cd, Ni) (Grimolizzi, 2019; Defensor del Pueblo de la Nación 2007). Esto hace que, la cuenca del río Reconquista, sea un sistema complejo que necesitan ser estudiados desde un enfoque interdisciplinario.

Si se tiene en cuenta la potencialidad de utilizar microorganismos resistentes a elementos tóxicos, se deberían evaluar los ambientes que presenten una elevada contaminación, como lo es el río Reconquista. Es por esto que el objetivo de mi tema de investigación se centra en la remediación de metales pesados, evaluando la potencialidad del uso de microalgas para ese proceso, pudiendo ser aplicado en industrias que vierten sus efluentes en el Reconquista, disminuyendo de este modo, la concentración de metales que ingresarían al río

Mecanismos de remediación y generación de metabolitos por microalgas

Remoción de metales

La remoción de metales utilizando microalgas se da mediante un complejo fenómeno denominado biosorción, el cual contempla procesos de adsorción (fenómenos de superficie) y de absorción (fenómenos de incorporación de sustancias). Generalmente los mecanismos de biosorción están basados en interacciones físico-químicas entre los iones metálicos y los grupos funcionales presentes en las microalgas, tales como carboxilo, hidroxilo, fosfato, amino, sulfhidrilo (Aquino et al., 2011)

El proceso de adsorción es rápido, independiente del metabolismo celular y ocurren en células viables y no viables. Diversos mecanismos se pueden dar en este proceso, algunos de ellos son: adsorción física, quimiosorción, coordinación, complejación, quelación, microprecipitación e intercambio iónico. Por el contrario, el proceso de absorción es lento, dependiente del metabolismo celular y solo ocurre en células viables. Esto se debe a que es un proceso en el cual los iones metálicos son transportados al interior de la célula, donde serán acumulados. Algunos de los mecanismos que pueden interferir en este proceso son: uniones covalentes, reacciones redox, cristalización en la superficie celular o difusión intracelular. Si bien todos los mecanismos son importantes para la remoción de los metales pesados, diversos autores han encontrado que el intercambio iónico es el que predomina (Salam, 2019; Suresh Kumar et al., 2015).

El intercambio iónico surge por la presencia de sitios activos en la superficie de las microalgas, dada la gran variedad de grupos funcionales que se encuentran en sus paredes celulares, otorgándoles a éstas un carácter negativo, con una alta afinidad por cationes. Naturalmente los protones se encuentran unidos a los sitios activos en valores de pH ácidos, o el calcio, magnesio o sodio en valores de pH básicos. Sin embargo, cuando hay presentes en el medio iones metálicos como Cu(II), Mn(II), Zn(II), Ni(II), Cd(II) entre otros, los protones y metales previamente unidos son desplazados, quedando estos nuevos metales adsorbidos a la superficie de la microalga, pudiendo luego ser transportados al interior de la célula (Fig. 1) (Salama et al., 2019).

Figura 1: Esquema de la adsorcion en la pared celular y
absorción intracelular de iones metálicosen una célula de microalga

Remoción de nutrientes

Diversos estudios han demostrado la capacidad de las microalgas de ser utilizadas en la reducción de nitratos y fosfatos presentes en aguas residuales, y esto se debe a que el nitrógeno y el fósforo forman parte de los macronutrientes que consumen las microalgas para su crecimiento.(Mennaa et al., 2015; Zhou et al., 2012; Mallick, 2002)

Dependiendo de la variedad de microalga que se tenga, van a cambiar la cantidad de nutrientes que necesiten y su capacidad de asimilarlos dependiendo de su estado químico, pero en todos los casos son necesarios en elevadas concentraciones. El nitrógeno es uno de los componentes esenciales de muchas biomoléculas claves, como aminoácidos y nucleótidos. La síntesis de proteínas normalmente depende de un adecuado suministro de nitrógeno. Por otro lado, el fósforo juega un papel importante en la mayoría de los procesos celulares, especialmente los que están implicados en la generación y transformación de energía metabólica, por lo que es indispensable para el crecimiento y reproducción de las microalgas. (González Gonzáles, 2019)

Generación de metabolitos

Las microalgas son capaces de generar una gran variedad de metabolitos secundarios, como pueden ser lípidos, proteínas, azúcares, polisacáridos, pigmentos, entre otros, que podrían llegar a tener un uso comercial. Dada esa diversidad de metabolitos, algunas microalgas ya han sido ampliamente estudiadas, incluso comercializadas, como puede ser el polvo o pastillas de Chlorella y espirulina (cianofitas del género Arthrospira), los cuales son utilizados como suplementos dietarios, dado su alto contenido proteico, en ácidos grasos esenciales, minerales y vitaminas. (García et al., 2017)

Otro ejemplo de metabolito pueden ser las sustancias poliméricas extracelulares (SPE) generadas por algunas especies de microalgas, las cuales estarían asociadas a la protección celular, dado que su generación se encuentra asociada a condiciones de estrés celular. Sin embargo, aún se encuentra en estudio cuál es su rol en la disminución de los contaminantes, así como también, su caracterización físico-química (Nazos et al., 2020; J. Zhao et al., 2019).

Por último, otro tipo de metabolitos que se destaca en la bibliografía, son aquellos utilizados para la generación de biocombustibles, como pueden ser los lípidos o hidrocarburos utilizados para biodiesel, o incluso la totalidad de la biomasa microalgal para generar un biocrudo mediante licuefacción hidrotermal (Gouveia et al., 2017; Tian et al., 2014)

Potenciales biotecnológicos de las microalgas

En el marco de mi tesis doctoral, teniendo en cuenta los diferentes usos biotecnológicos que pueden tener las microalgas, hemos aislado distintas especies del río Reconquista para evaluar su potencialidad en remediación y generación de metabolitos. A continuación se detallan algunos de los resultados obtenidos.

· Caracterización físico-química de los sitios de estudios ubicados en el río Reconquista
(Fig. 2). Algunos de los parámetros físicos medidos en situ fueron la temperatura, conductividad, pH, oxígeno disuelto y turbidez. Mientras que la caracterización química se llevó a cabo en el laboratorio, donde se determinaron parámetros como: nitritos, nitratos, amoniaco, fosfato, sulfatos, demanda química de oxígeno, metales pesados en solución, entre otros.

Figura 2. Cuenca del Río Reconquista y sitios de estudio. Mapa tomado de: https://www.gba.gob.ar/comirec/mapas

· Aislamiento de microalgas. A partir de muestras de aguas y sedimentos obtenidas en los distintos puntos de muestreo, se realizó el aislamiento por pulverizado en placa de petri de distintas especies de microalgas (Wiedeman et al., 1964) (Fig. 3), tales como: Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2, Desmodesmus sp. 1, Desmodesmus sp. 2. A su vez, se cuenta con una cepa de Botryococcus braunii procedente del cepario de Algal Culture Center of the University of Texas.

A	B
C	D
E	F

Figura 3. A: muestra de agua del río Reconquista.
B: Placa de aislamiento con distintas microalgas por parcela.
C: Chlorella sp.1.
D: Chlorella sp. 2.
E: Desmodesmus sp. 1.
F: Desmodesmus sp. 2.

· Mantenimiento de cultivos y evaluaciones de toxicidad. Una vez que las microalgas son aisladas, se evalúa qué medio de cultivo es el óptimo para su crecimiento, al igual que las condiciones de temperatura, agitación, intensidad lumínica e intervalos de luz : oscuridad.

Teniendo en cuenta que las microalgas serán utilizadas para la remediación de metales pesados, primero se deben evaluar los efectos tóxicos de los mismos sobre las células. Para esto se las cultivan bajo las condiciones óptimas de crecimiento, pero ahora se les agrega distintas concentraciones conocidas de metal. De este modo se evalúa la cinética de crecimiento como recuento celular, densidad óptica o peso seco, en función del tiempo, obteniéndose la velocidad específica de crecimiento y productividad de biomasa. En la Fig. 4 se puede apreciar a simple vista cómo se puede ver afectado el crecimiento de la biomasa a distintas concentraciones de un metal. También se pueden realizar ensayos respirométricos donde se evalúan los efectos de los metales sobre el metabolismo de respiración y de fotosíntesis de la biomasa (analizador de gas Micro-Oxymax Columbus instrument©); o incluso, hacer una cuantificación de metabolitos (lípidos, proteínas, clorofila). Teniendo en cuentas todos estos datos, se podría inferir cuáles son los efectos del metal en la biomasa, y si es factible o no que la misma sea utilizada para la remediación.

Figura 4. Efectos de distintas concentraciones de Zn(II) (8,5; 25; 45 y 80 mg/l)
sobre el crecimiento de Chlorella sp. 1, luego de 28 días.

· Remediación de metales pesados. Estos estudios se llevan a cabo en términos de procesos metabólicamente acoplados y no metabólicamente acoplados, con el fin de evaluar los distintos mecanismos de remoción de los metales.

En este sentido, luego de diversos trabajos realizados en los que se evaluaron distintas especies de microalgas y distintos metales, se pudo determinar que el metabolismo de la biomasa juega un rol fundamental en la remediación de metales (Fig. 5). Esto se da debido al aumento de pH del medio por el consumo de protones asociado a su actividad fotosintética, generando de este modo, la precipitación de los metales como óxidos, hidróxidos u otros complejos, dependiendo de la solubilidad de cada metal.

A	B
C	D

Figura 5. A: remoción total de Zn(II) (□) por Chlorella sp.1 y pH finales (●) para distintas concentraciones iniciales (13, 20, 33 y 46 mg/l), luego de 28 días, pH inicial 5.
B: remoción total de Zn(II) (□) por B. braunii y pH finales (●) para distintas concentraciones iniciales (10, 20, 36 y 46 mg/l), luego de 35 días, pH inicial 5.
C: remoción total de Ni(II) (□) por B. braunii y pH final (●) para distintas concentraciones iniciales
(3, 5, 9 y 15 mg/l), luego de 50 días, pH inicial 5.
D: remoción total de Cu(II) (□) por B. braunii y pH final (●) para distintas concentraciones iniciales
(2, 4 y 10 mg/l), luego de 24 días, pH inicial 4,5.

A su vez, la biomasa tiene la capacidad de realizar una remoción pasiva a partir de procesos de adsorción sobre la superficie celular, procesos que pueden ser descriptos en términos cinéticos y evaluados a partir de distintos modelos de isotermas de adsorción. En la Fig. 6 se muestran los resultados de la máxima capacidad de adsorción del metal (q_max) expresada en miligramo de metal adsorbido por gramo de biomasa, utilizando distintos metales y distintas microalgas. Los resultados también demostraron que las distintas microalgas estudiadas presentan diferentes afinidades por los distintos metales.

Figura 6. Remoción de metales (zinc, níquel y cobre) utilizando dos especies de microalgas
(Chlorella sp. 1 y B.braunii), mediante mecanismos no metabólicamente acoplados,
a un pH inicial de 5 y temperatura de 23°C.

• Potencial de remediación de efluentes reales. Una vez que se evalúa tanto la toxicidad de los contaminantes, como la capacidad de remediación de las microalgas, se pueden seleccionar las más eficientes para realizar pruebas a escala piloto con efluentes reales, en donde coexisten diversos contaminantes en solución. En la Fig. 7 se muestran los resultados de remediación de un lixiviado de sedimentos del Río Reconquista, en dónde se evaluó la remoción de cobre, níquel hierro, nitratos y variación de carbono orgánico total. 
  
  

Figura 7. Concentraciones de cobre (Copper), níquel (Nickel), hierro (Iron), nitratos (Nitrates)
y carbono orgánico total (TOC) antes y luego del tratamiento con B.braunii.
Tomado de Areco et al. 2018

· Generación de metabolitos. El tipo y cantidad de metabolito producido durante los procesos de remediación van a depender de las condiciones físico-químicas del medio y del tipo de microalga. En las experiencias realizadas para el análisis de los metabolitos se utilizaron distintas técnicas, por ejemplo: i) Extracción de clorofila a y b con metanol u otro solvente y análisis por espectrofotometría; ii) lípidos por técnica colorimétrica utilizando sulfo-fosfo vainillina, en donde se determina la concentración de lípidos totales (Cheng et al., 2011), o también determinando la composición lipídica mediante cromatografía líquida de alta eficiencia con un detector de masas (HPLC-MS) (MacDougall et al., 2011); iii) proteínas, al igual que los lípidos, determinadas mediante el método de Bradford, para proteínas totales (Bradford, 1976), o mediante HPLC-MS; iv) las SPE son de hecho un poco más complejas de evaluar, dado que pueden tener un porcentaje variable de azúcares, lípidos, proteínas y demás compuestos, dependiendo de la microalga que la produzca. Para este caso, primero se realiza la identificación en microscopio óptico (Fig. 8 A) o electrónico de barrido (Fig. 8 B), incluso muchas veces se puede apreciar a simple vista su presencia en el cultivo. Realizando una extracción de la sustancia se puede analizar por Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR).

A

B

Figura 8. A: Imagen de microscopio óptico de Chlorella sp.1 con 20 mg/l de Zn(II).
B: Imagen de microscopio electrónico de barrido del mismo cultivo de Chlorella sp.1 visto en A.

A modo de ejemplo, en la Tabla 1 se puede observar cómo varían las concentraciones de algunos de los metabolitos por nosotros estudiados cuando Chlorella sp. 1 es expuesta a concentraciones variables de Zn(II) y B. braunii a Cu(II).

Conclusiones

En función de los resultados obtenidos de las distintas microalgas, se ha demostrado la capacidad de ser cultivadas en ambientes extremos, con presencia de metales pesados, variaciones de nutrientes, pH levemente acidificado, entre otros. Esto ha permitido evaluar su potencialidad en procesos de bioremediación de metales y nutrientes, y su capacidad de generar metabolitos de interés comercial, a lo largo de dichos procesos. En este sentido, se podría pensar a las microalgas como materia prima en procesos de biorefinería, donde sería posible la revalorización de efluentes industriales para su cultivo, logrando no solo bajar la carga de contaminantes, sino también suplantar el uso de agua y sales necesarios para su cultivo, mientras que, al mismo tiempo, se podrían generar metabolitos de alto impacto económico, por ejemplo, con potencial energético.

Referencias

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1. Instituto de Investigación e Ingeniería Ambiental (IIIA), CONICET-UNSAM. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) [↩] [↩]
2. Instituto de Investigación e Ingeniería Ambiental (IIIA), CONICET-UNSAM. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) [↩]

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