F. Pretz1 , G. Curutchet1 , D. Pasquevich2
Contaminación por metales
El término contaminación ambiental se utiliza cuando, en un medio natural, se introduce cualquier sustancia por encima del nivel aceptable, representando un impacto negativo en el ambiente (Novotny 1995). Hay una gran cantidad de compuestos y elementos que se pueden considerar como contaminantes, entre ellos se encuentran los metales pesados, cuya presencia en el ambiente últimamente ha incrementado exponencialmente debido al crecimiento de la actividad industrial.
Algunas actividades que llevan a la contaminación ambiental con metales suelen ser la minería, galvanoplastía, metalurgia, producción de baterías, pinturas o plásticos, abuso de fertilizantes e irrigación con aguas residuales. Su alta concentración es un problema pues son difíciles de degradar química o biológicamente, en suelos es muy difícil separarlos y resultan tóxicos para los organismos (Yang 2018).
Los efluentes de estas industrias, inadecuadamente o no tratados, provocan la dispersión de metales tóxicos en cuerpos de agua superficiales y subterráneos, suelos y sedimentos cercanos a la zona.
La toxicidad de los metales sobre un organismo se puede definir como el potencial intrínseco de los mismos para causar efectos negativos sobre los organismos vivos, y depende de su biodisponibilidad (Rasmussen et al 2000). Además, la amenaza para la salud de humanos y animales por parte de los metales pesados está agravada por su gran persistencia en el ambiente, ya que, debido a su carácter recalcitrante, se acumulan en los sustratos y son bioacumulados y biomagnificados por los organismos tolerantes que se encuentran en los sitios contaminados (Dembitsky, 2003; Manohar et al., 2006; Doshiet al., 2007).
Contaminación con Uranio en Argentina
El uranio fue descubierto en el año 1789 aunque recién cobró relevancia en 1938 cuando Hahn, Strassmann y Meitner descubrieron la fisión de su núcleo y sentaron las bases para el desarrollo de la energía nuclear. Desde entonces, esta forma de energía presenta una alternativa con bajos niveles de emisión de dióxido de carbono que la hace elegible en la actualidad para mitigar el cambio climático (Gregui, 2009). La contracara de esta característica favorable es que la minería de uranio y su uso industrial han dejado pasivos ambientales desde que su explotación creciera exponencialmente a partir de 1942.
En Argentina, emprendimientos de minería y procesamiento de uranio han provocado pasivos ambientales desde la segunda mitad del siglo XX. La Comisión Nacional de Energía Atómica, a través del Proyecto de Restitución Ambiental de la Minería del Uranio (PRAMU), tiene el objetivo de lograr la restitución ambiental de aquellos sitios en donde se desarrollaron actividades mineras en nuestro país, de acuerdo a lo establecido en la Ley N° 25.018 / 97 de “Régimen de gestión de residuos radiactivos de la minería del uranio”.
Sitio de trabajo
El humedal natural de trabajo se encuentra próximo al Complejo Tecnológico Pilcaniyeu (CTP) de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA) en Río Negro, Argentina. Constituye un pasivo ambiental declarado por CNEA, que fue contaminado durante la década de 1990 con U, Ni, Sn y Cu.
El humedal se ubica a la salida de la planta de tratamientos cloacales del CTP, pero inicialmente, cuando aún no había regulaciones ambientales claras, también se volcaban en el mismo las aguas de lavado de los laboratorios. Con el tiempo, esto llevó a la acumulación de metales en sus sedimentos.
En las siguientes figuras se presentan un mapa del área del CTP, uno de la ubicación del humedal y luego fotos del sitio donde se extrajeron las muestras.
Figura 1: Ubicación del CTP y del humedal de trabajo
Figura 2: Fotos del humedal donde se extrajeron muestras
Objetivos del doctorado
En el marco de las problemáticas ambientales planteadas y considerando el sitio que se eligió, se ha planteado la propuesta de trabajo de este doctorado. Consiste en desarrollar procesos de biocomplejación, biorreducción y principalmente de biorremediación de humedales naturales, y en particular apuntar a contribuir con encontrar una solución innovadora para el problema de contaminación que presenta el humedal natural que se encuentra en la provincia de Río Negro, Argentina.
Como objetivos particulares se tienen:
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- Caracterizar fisicoquímica y estructuralmente los sedimentos del humedal de Pilcaniyeu. Relacionar la microestructura de los sedimentos frente al grado de contaminación, la composición cuantitativa de metales y su especiación.
- Estudiar grupos de microorganismos de interés, tales como hongos formadores de ácidos orgánicos, bacterias hierro y azufre oxidantes, hierro reductoras, sulfato reductoras y productoras de complejantes que se encuentren en el humedal. Enriquecer y aislar los principales géneros.
- Aplicar estos microorganismos a la biolixiviación de uranio y otros metales del humedal. Dilucidar el mecanismo y la cinética de la biolixiviación.
- Combinar los procesos de biolixiviación desarrollados con otras técnicas fisicoquímicas y biológicas para la recuperación de metales a partir de los lixiviados. Acondicionar los sedimentos remediados.
El proceso de biolixiviación de metales pesados
La biolixiviación es una de las técnicas de biorremediación, y su aplicación sobre uranio y otros metales como cobre ha sido objeto de estudio de la comunidad científica internacional y de la industria minera desde que se descubrió que algunos microorganismos jugaban un rol fundamental en el drenaje ácido de minas y se aisló una cepa de Thiobacillus ferrooxidans (hoy día llamado Acidithiobacillus ferrooxidans) (AMD; Colmer y Hinkle, 1947 y Temple and Colmer 1951 en Olson et al. 2003). La extrapolación de estas técnicas a residuos contaminados es una de las líneas actuales de investigación más prometedoras en este campo. (Porzionato 2016). Este proceso se encuentra en constante perfeccionamiento desde fines de los años ‘80 y ha sido aplicado al tratamiento de sustratos contaminados con metales como U, Pb, Ni, Zn, Cu, etc. (Gadd, 2004; Ren et al, 2009; Kim et al 2016).
Algunas bacterias que se conocen por su capacidad de biolixiviación son Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans, Leptospirillum ferriphilum, Sulfolobus spp y Acidians bierleyi. (Gadd 2010). Dentro de ellas, las dos primeras son las más estudiadas y aplicadas. Son gram negativas, no formadoras de esporas, acidófilas, aeróbicas, mesófilas y quimiolitoautotróficas. Utilizan dióxido de carbono atmosférico como fuente de carbono y obtienen energía de la oxidación de sulfuros completa o parcialmente reducidos, generando sulfato como producto final. A. ferrooxidans, además, puede usar ion ferroso como fuente de energía, oxidándolo a ion férrico.
La biolixiviación básicamente se basa en la oxidación de sulfuros a sulfatos por el metabolismo de microorganismos autótrofos y acidófilos (Watling 2006). La actividad metabólica de distintos microorganismos es capaz de generar medios lixiviantes que pueden movilizar metales contaminantes presentes en el sedimento a fase acuosa desde donde podrán ser recuperados.
La estructura del sedimento y las formas químicas en las que están presentes los metales juegan un rol crucial en la regulación del proceso de lixiviación por lo que conociendo las variables claves cinéticas, estructurales y estequiométricas se podrá optimizar el proceso.
Las bacterias reductoras
Las bacterias acidófilas mencionadas anteriormente son las que en condiciones aeróbicas oxidan los sedimentos generando que los metales pasen a solución. Su actividad metabólica es uno de los motivos por los cuales hay movilización de estos contaminantes.
Por otro lado se tiene que cuando las condiciones de los sedimentos se vuelven anaérobicas, las bacterias que actúan son las reductoras de hierro y sulfato. Estas generan la precipitación de compuestos que hacen que los metales queden immovilizados. Son heterotróficas por lo que usan compuestos orgánicos como fuente de carbono y usan sulfato u óxidos de hierro como aceptores de electrones.
Como objetivo de la tesis se tiene aislar ambos tipos de bacteria para aplicar sobre los sedimentos del humedal, tanto para generar el proceso de biolixiviación de metales como para luego recuperarlos.
Metodología utilizada
Del humedal se tomaron tres muestras, dos correspondientes al faldeo del mismo (F1, F2) y dos correspondientes al cauce (C).
Se realizaron ensayos de caracterización fisicoquímica a las muestras: El pH se determinó en una dilución 1:2 del sedimento; La humedad por secado a 80°C; La materia orgánica por calcinado a 550°C; Los sulfuros volátiles en ácido (SVA) por el método de purga y trampa: se realiza una extracción con ácido clorhídrico y se cuantifica por conversión a azul de metileno; Los sulfatos se determinaron por extracción con ácido clorhídrico y posterior cuantificación por turbidimetría con cloruro de bario; El contenido de hierro se determinó por extracción con ácido clorhídrico y cuantificación con o-fenantrolina.
Luego las muestras fueron secadas al aire y tamizadas con un tren de tamices de 4750, 1000, 500, 150 y 75 µm.
A las fracciones de tamaño menor a 75µm se las analizó por microscopía electrónica de barrido (SEM) y con las técnicas de adsorción de nitrógeno e intrusión de mercurio.
Además, se comenzó a cuantificar la cantidad de metales presentes en las muestras. Para ello se realizó una extracción secuencial de metales a las muestras completas húmedas (con tratamientos sucesivos sobre las muestras utilizando diferentes reactivos para obtener cuatro fracciones: intercambiable, reducible, oxidable y residual) y una digestión microondas con ácido nítrico a las muestras completas y cada fracción de tamizado. Se realizó la cuantificación por absorción atómica.
Resultados preliminares
Los primeros análisis obtenidos se presentan en la siguiente tabla: 
Tabla 1: Análisis realizados a muestras.
En estos resultados obtenidos se observa que todas las muestras poseen un pH, humedad y cantidad de materia orgánica similares. En ninguna se cuantifica presencia de sulfuros metálicos. Para la muestra de cauce se ve que contiene valores algo más elevados de sulfatos y de hierro que las de faldeo. Y en todos los casos, el contenido de hierro es mayormente en estado oxidado.
A continuación se presentan los resultados correspondientes a la distribución en peso para las fracciones en la Figura 3, del análisis por SEM en la Figura 4 y en la Tabla 2 los obtenidos en la porosimetría y adsorción de nitrógeno.
Figura 3: Distribución en peso de las fracciones de tamizado
Se observa que las fracciones mayores a 1mm de tamaño son las que representan el mayor contenido.
Figura 4: Resultados de SEM para las muestras analizadas.
En las imágenes se ve que el tamaño de partículas es muy variado, pero consistente con que es menor a 75µm de diámetro. En todas las muestras se observaron restos de diatomeas. Esto coincide con la información que se tiene de la zona muestreada, que tiene épocas de alto volumen de agua, en las cuales estas algas unicelulares se pueden depositar en los sedimentos.
Tabla 2: Cuadro comparativo de resultados obtenidos por intrusión de mercurio y adsorción de nitrógeno
Entre ambas técnicas se puede obtener una información completa sobre la porosidad de la muestra. Con la intrusión de mercurio se caracterizan principalmente los macroporos y con la adsorción de nitrógeno mayormente los micro y mesoporos. Aunque no es correcto hacer una comparación directa pues cada técnica toma distinta información de la estructura de poro: en el caso de la intrusión de mercurio la misma se encuentra controlada por la garganta del poro, mientras que la adsorción de nitrógeno está controlada por el cuerpo del poro.
Se ve que el volumen total de poros usando mercurio es mayor al obtenido con nitrógeno, y esto puede deberse a que haya macroporos que con la última técnica no es posible cuantificar.
En las Figuras 5 y 6 se presentan los resultados obtenidos para la cuantificación preliminar de metales:
Figura 5: Cuantificación de Ni en las extracciones secuenciales de metales
En la extracción secuencial de metales se observa que en la muestra del cauce hay un mayor contenido de níquel, y que la distribución del metal en cada fracción es relativamente pareja.
Figura 6: Cuantificación de Zn y Ni en las fracciones de tamizado.
En la distribución por fracción de tamizado, nuevamente se observa una mayor cantidad de metales en la muestra de cauce. Y por otro lado, en esta muestra la fracción de tamaño entre 1000 y 4750µm es la que acumula la mayor cantidad del metal.
Aislamiento de bacterias
Para aislar A. thiooxidans se utilizó el medio 0K y para aislar A. ferrooxidans el 9K. Se colocó sedimento en erlenmeyers con cada medio de cultivo y se dejó agitando a temperatura ambiente. Periódicamente se realizaron mediciones de hierro y acidez para evaluar el crecimiento. En cuanto a las bacterias anaeróbicas, su aislamiento se llevó a cabo en medio Geobacter y Postgate en frascos sellados y purgados con nitrógeno.
No se consiguió aislar A. ferrooxidans ni A. thiooxidans. Esto puede ser explicado por la falta de sustratos en los sedimentos: sulfuros y hierro en estado de oxidación reducido.
Sí pudieron ser enriquecidas las bacterias reductoras de hierro (BRH) y bacterias reductoras de sulfato (BRS) usando los medios de cultivo Geobacter y Postgate respectivamente.
Las BRH enriquecidas de la muestra de cauce se hicieron crecer en celdas electroquímicas esperando poder seleccionar bacterias electrogénicas. Como se muestra en la Figura 7, en donde se ven los resultados de un experimento de 350hs, la corriente de la celda correspondiente a Cauce es mayor a la del Control, indicando presencia de microorganismos electrogénicos.
Figura 7: Resultados para la cronoamperometría realizada en las celdas electroquímicas.
Conclusiones y perspectiva a futuro
Si bien todavía falta realizar análisis fisicoquímicos para caracterizar profundamente los sedimentos, se logró una buena identificación inicial. Se terminarán de cuantificar los metales, y en particular para uranio, que ya se sabe que está presente en las muestras pero aún la técnica de cuantificación está siendo llevada a punto.
También se realizarán los ensayos de biolixiviación con cepas stock ya identificadas y certificadas.
Se espera poder realizar los ensayos satisfactoriamente, y poder elucidar en los mismos con qué mecanismo ocurre y cuál es su cinética.